|
Activities & Results |
|
2015 During this stage we have established the main working conditions for the implementation of the nanopore based technique employed for the quantification of peptide transport through a single α-hemolysin protein pore embedded in a planar lipid membrane, in the presence of lipid vesicles and bacterial cells. Based on our control experiments, we have chosen DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) as the optimal lipid to support the embedded α-HL protein pore in order to achieve stable working conditions for the electrophysiology experiments (long recording times in the presence of relatively high concentrations of peptides; absence of transmembrane peptide pores into the support bilayer in the presence of an external voltage; stability of the bilayer in extreme salt concentration and pH conditions, and in the presence of liposomes or bacterial cells). We have established the working protocols employed for the formation of small unilamellar vesicles (SUVs), supported lipid bilayers (SLBs), and giant unilamellar vesicles (GUVs), as model membranes mimicking eukaryotic, and bacterial cells respectively. These systems were tested in control experiments: ► fluorescence spectroscopy measurements based on the shift of the emission spectra of tryptophan residues upon adsorption of a test, Trp containing peptide at the bilayer interface of SUVs; ► confocal microscopy experiments in order to monitor and image the interaction of unlabeled, and fluorescently labeled peptides with GUVs; ► atomic force microscopy and force spectroscopy measurements in order to test the formation of SLBs on mica substrates. We tested and correlated the influence exerted by parameters of the physiological medium (e.g.: pH, type of salt, ionic strength) on the kinetics of association between peptides and the protein pore, with their influence upon lipid vesicles mimicking bacterial cells (e.g., aggregation, alteration of peptide adsorption). We choose to conduct out future electrophysiology experiments in 0.5 M KCl electrolytic solutions, buffered with 10 mM HEPES for neutral pH values, and 10 mM MES for acidic pH values, respectively. The salt concentration is high enough to allow good readings of the ionic current recordings through a single α-HL channel, yet kept as low as possible in order to avoid significant electrostatic screening of lipids, peptides and protein electrical charges to prevent aggregation of bacterial cells and liposomes due to reduces electrostatic repulsion, and not to impede the interaction between cationic peptides and negatively charged lipids on the surface of liposomes and bacteria. The system is stable in acidic environments, but we have to keep in mind that α-HL bares a series of charged amino acids at the entrance of its transmembrane lumen which give a net electric charge of -7 at pH = 7. This net negative charge is significantly reduced in acidic environments due to protonation of basic amino acids, and can be used as such to tune interactions between charged particles and the protein nanopore.
2016 În cadrul ETAPEI II am continuat investigațiile asupra asocierii peptidelor antimicrobiene la membrana sistemelor lipidice model (SUVs), prin măsurători indirecte furnizate de monitorizarea și analiza statistică a curentului ionic mediat de un nanopor proteic la nivelul căruia apar fenomene de blocaj datorate pătrunderii peptidelor libere în lumenul porului proteic și a obstrucționării acestuia. Astfel de experimente au fost realizate și utilizând celule bacteriene (E. coli) și a fost pusă în evidență adsorbția peptidelor pe suprafața celulelor patogene. Într-o altă serie de experimente, am pus bazele unei tehnici de detecție a bacteriilor bazate pe însăși interacțiunea reversibilă a acestora cu porul proteic. Am demonstrat potențialul unei tehnici bazate pe un singur nanopor proteic inserat într-o membrană lipidică reconstituită pentru detecția în timp real a unor bacterii Gram-negative selectate (Pseudomonas aeruginosa și Escherichia coli) aflate în suspensie apoasă în concentrație de 1.2×10^8 cfu/mL. Sarcina electrică netă negativă prezentă pe fața externă a bacteriilor promovează migrarea electroforetică a celulelor bacteriene către un singur por proteic de α-hemolizină (α-HL) inserat într-o membrană planară constituită din DPhPC, sub acțiunea unui câmp electric generat în urma aplicării unor diferențe de potențial transmembranare negative. Migrarea bacteriilor înspre α-HL este urmată de captura acestora la gura de intrare a porului într-o manieră modelată prin teoria clasică Kramers. Utilizând o peptidă antimicrobiană specifică ca element de biorecunoaștere moleculară pentru bacteriile utilizate, am arătat că sistemul de detecție descris are abilitatea de a combina sensibilitatea tehnicilor de detecție moleculară bazate pe nanopori cu procese de recunoaștere biologică selectivă și subliniază fezabilitatea unei astfel de platforme bazate pe nanopori pentru sisteme portabile de analiză și monitorizare a patogenilor de natură bacteriană. De asemenea, am realizat experimente de microscopie de fluorescență la nivel de singură moleculă, pentru a investiga dinamica fosfolipidelor membranare în cadrul bistraturilor lipidice model cu proprietăți mecanice diferite, respectiv dinamica și mecanismele de interacțiune ale unor peptide antimicrobine la nivelul membranei lipozomilor care mimează membrane bacteriene, respectiv membrane eucariote. Rezultatele experimentale au pus în evidență diferențe de mobilitate lipidică între membrane cu proprietăți mecanice diferite, formate din lipide saturate (DPPC), respectiv nesaturate (DOPC). Prezența legăturilor duble în structura cozilor hidrocarbonate ale lipidelor le conferă acestora flexibilitate și crește fluiditatea miezului hidrofob al membranei, facilitând difuzia moleculelor în planul bistratului. De asemenea, am studiat procesele de interacțiune dintre peptide antimicrobiene și sisteme lipidice biomimetice care mimează membrana eucariotă (PC), respectiv bacteriană (PC+PG), încărcată electric negativ. Rezultatele au arătat că afinitatea peptidelor cationice este mai mare pentru membrane care conţin PG datorită interacţiunilor de atracţie electrostatică. A fost pusă în evidenţă formarea agregatelor peptidice (pori) în ambele tipuri de membrane. În membrane anionice (PC/PG), au putut fi detectate și peptide în stare monomerică, cu un coeficient de difuzie de aproximativ patru ori mai mare decât cel al agregatelor. Acestea nu au putut fi observate în membrane neutre (PC), datorită ratei mari de disociere a peptidelor în absenţa interacţiunilor de atracţie electrostatică.
2017 În cadrul ETAPEI III am continuat investigațiile prin tehnici complementare de microscopie confocală, studiind adsobția și internalizarea unor peptide membranar active la nivelul bistraturilor lipidice ale lipozomilor gigant (GUVs) de compoziție diferită. Datorită dimensiunilor mari, a formei sferice și a posibilității de a modifica compoziția lipidică în funcție de natura investigațiilor, aceste membrane biomimetice model sunt ideale pentru a mima și studia comportamentul unor agenți membranari activi la nivelul celulelor. Am construit astfel sisteme lipidice model care mimează membrana celulelor eucariote, formate din lipide neutre, respectiv care mimează membrana celulelor bacteriene, care conțin în compoziția lor lipide încărcate electric negativ (PG, PS) sau lipide cu o curbură intrinsecă negativă (PE). Așa cum fosfatidilcolina este principala componentă a membranelor eucariote, fosfatidiletanolamina joacă un rol major în structura membranelor bacteriene, compensând prin forma sa conică respingerile electrostatice dintre capetele polare încărcate electric net negativ (ce induc astfel o curbură pozitivă a bistratului), și echilibrând mecanica bistratului. Utilizând diverse peptide cationice membranar active marcate fluorescent, am pus în evidență prin înregistrări de microscopie confocală mecanismele de interacțiune ale acestor peptide la nivelul membranelor biomimetice. Rezultatele au subliniat rolul major al lipidelor încărcate negativ, respectiv al etanolaminei (componente ale membranelor bacteriene), în procesele de adsorbție membranară, internalizare și formare a porilor transmembranari. Interacțiunea dintre peptidele cationice și membrane biomimetice neutre a fost minimă, ea depinzând de proporțiile de lipide încărcate și fosfatidiletanolamină prezente în sistem, subliniind rolul acestora în selectivitatea acestor peptide față de celule bacteriene. Am desfășurat de asemenea o serie de experimente de spectroscopie de forță atomică, bazate pe funcționalizarea chimică a probelor AFM cu peptide antimicrobiene, pentru a pune în evidență interacțiunea selectivă a acestora cu bistraturi lipidice ce mimează membranele bacteriene și am reușit să determinăm tăria interacțiunii la nivel uni-molecular dintre o singură moleculă peptidică și membrana biomimetică. Funcționalizarea chimică a probelor AFM s-a realizat prin cuplarea peptidelor la suprafața de siliciu amino-funcționalizată a vârfului prin intermediul unor molecule linker PEG bi-funcționale. Curbele de forță înregistrate pentru interacțiunea dintre vârfuri AFM funcționalizate cu peptide antimicrobiene și bistraturi lipidice depuse pe suport solid (SLBs) au arătat că peptidele se adsorb prevalent la nivelul membranelor cu sarcină electică superficială netă negativă (membrane bacteriene), subliniind încă o dată rolul lipidelor cu capete polare încărcate electric net negativ în selectivitatea AMPs. Magnitudinea forțele de interacțiune dintre o singură peptidă cationică cu structură secundară de α-helix și bistraturi bacteriene model, determinată în urma experimentelor de spectroscopie de forță atomică, a fost de aproximativ 60 pN. |
